鮸鱼过氧化物还原酶Peroxiredoxin基因的分子克隆与表达分析

【摘要】鮸鱼是我国重要的经济价值较高的鱼类，主要分布于北太平洋西部，包括中国的黄渤海及东海、朝鲜和日本南部，生存环境的恶化和致病菌的感染给鮸鱼养殖业带来了严重影响。过氧化物还原酶Peroxiredoxin是抗氧化酶家族中的一员，广泛存在于各种生物体内，能够通过消除细胞内的过氧化氢和烷基过氧化氢等来维持细胞内的氧化还原的平衡。本论文对鮸鱼的1-CysPrx和典型以及非典型的2-CysPrx基因进行研究，以期阐明抗氧化蛋白Prx在鮸鱼免疫统中的作用机制，为鱼类抗病机理研究提供理论依据。1.鮸鱼1-Cys过氧化物还原酶的克隆及表达分析的研究1-Cys类Prx指的是Prx6，鮸鱼Prx6基因的cDNA序列全长909bp；其中5’端不翻译区（UntranslatedRegions，UTR）为19bp，3’UTR为224bp，开放阅读框(OpenReadingFrame，ORF)为663bp，可以编码220个氨基酸。对其进行同源性分析发现，鮸鱼Prx6含有1-CysPrx均含有的共同的保守催化中心“PVCTTE”和脂肪酶序列“GNSWG”。鮸鱼Prx6二级结构经过氨基酸序列分析发现含有五个α螺旋、九个β折叠。RT-PCR（realtimePCR）表达分析显示：Prx6在肝、脾、肾、肠、心、肌肉、眼、鳃、鳍、脑等组织中均有表达，其中Prx6在肝脏中的表达最强，显著高于其他组织。其次是脾和肌肉，Prx6在肾中的表达最弱。在对鮸鱼的免疫相关组织（肝脏、脾脏、肾脏）注射致病菌感染72h中，肝脏的表达量上升，在24h达到最高点，脾脏在12h时达到表达最高点。说明在感染致病菌时，Prx6具有正反馈反应，暗示了在鮸鱼免疫相关组织中Prx6可能参与其免疫防御反应。2.鮸鱼2-Cys过氧化物还原酶的克隆及表达分析的研究2-CysPrx包括典型和非典型2-Cys，典型2-Cys包括Prx1~Prx4，非典型2-Cys指的是Prx5。其中鮸鱼Prx2基因的cDNA序列全长882bp；其中5’UTR为46bp，3’UTR为245bp，ORF为591bp，可以编码196个氨基酸。鮸鱼Prx3基因的cDNA序列全长1041bp；其中5’UTR12bp，3’UTR为282bp，ORF为747bp，可以编码248个氨基酸。鮸鱼Prx4基因的cDNA序列全长883bp；其中5’UTR为69bp，3’UTR为31bp，ORF(开放阅读框)为783bp，可以编码260个氨基酸。鮸鱼Prx5基因的cDNA序列全长1160bp；其中5’UTR为245bp，3’UTR为342bp，ORF为573bp，可以编码190个氨基酸。Prx2中含有五个α螺旋、七个β折叠；鮸鱼Prx3的二级结构中含有七个α螺旋、七个β折叠；鮸鱼Prx4中含有六个α螺旋、六个β折叠；鮸鱼Prx5中含有五个α螺旋、七个β折叠。RT-PCR结果表明，Prx2、Prx3、Prx4和Prx5基因在所选鮸鱼的10个组织中均有表达，其中Prx2在鳍中表达量最高,在肾中表达量最低。Prx3在肝脏中表达量最高，眼中最低。Prx4在脾中表达量最高，在肌肉中表达量最低。而Prx5在肌肉中表达量最高，肾脏中Prx5的表达量最低。鮸鱼感染鳗弧菌后：在肝中，Prx2、Prx3、Prx4和Prx5的表达量有明显的增加，它们是未感染状态的3.8~24倍。除了Prx5外，Prx2~Prx4基因的表达量48h后均恢复到起始水平或者之下。在脾中，Prx2和Prx4的表达水平处于未感染状态的表达水平或之下，而Prx3和Prx5均在感染24h后Prx基因的表达量有明显的增加。在肾中，Prx2和Prx3均在感染48h后Prx基因的表达量有明显的增加，分别是未感染状态的7倍和10倍；而Prx4和Prx5在感染72h后Prx基因的表达量仍然还有增加的趋势。结果表明这些基因的表达在鮸鱼遭受自病菌侵害时具有积极的抗病反应。
【作者】任丽平；
【导师】石戈；
【作者基本信息】浙江海洋学院，海洋生物学，2014，硕士
【关键词】鮸鱼；过氧化物还原酶；基因克隆；RT-PCR；

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